عنوان مالکیت فکری: کیت تشخیصی LAMP جهت ردیابی سریع عامل بیماری تولارمی

خلاصه اختراع

فرانسيسلا تولارنسيس عامل بيماري تولارمي (به عنوان بيماري شبه طاعون جوندگان) معرفي شده است. اين پاتوژن به عنوان يكي از جنگ افزارهاي بيولوژيك خطرناك به شمار مي آيد كه داراي خاصيت عفونت زايي شديد، قابليت انتشار آسان و ظرفيت بالاي ايجاد بيماري و مرگ مي باشد، بنابراين در گروه A عوامل بيوتروريستي قرار دارد. اين باكتري قادر به ايجاد عفونت در انسان از طريق پوست، غشاهاي مخاطي، دستگاه گوارش و ريه ها مي باشد. از آنجا كه تولارمي انساني، بيماري نسبتاً نادري است در صورت مواجه شدن با آن ممكن است بوسيله پزشكان با ظن قوي مطرح نگردد و بدون تشخيص باقي بماند. تكنيك تكثير هم دما به واسطه حلقه (Loop Mediated Isothermal Amplification) يا (LAMP) يك روش تكثيري و مولكولي منحصر به فرد بوده كه در اين روش DNA باكتري مي تواند در شرايط هم دما (يك دما) و تنها با استفاده از يك آنزيم تكثير يابد و به دناتوراسيون DNA الگو (مانند PCR) نيازي نيست. كيت LAMP بر اساس تكنيك قوي و جديد تكثير ژن است كه در حال حاضر ابزار تشخيصي سريع و ساده براي شناسايي عوامل ميكروبي مي باشد. كل اين روش بسيار سريع و آسان مي باشد زيرا عمليات تكثير در كمتر از يك ساعت و تحت شرايط هم دما (65 درجه سانتي گراد) انجام مي گيرد. اين روش به كمك يك مجموعه پنج پرايمر اختصاصي كه شش ناحيه متمايز را در ژن پيدا مي كند و به وسيله انكوبه كردن كل مواد و پرايمر ها در يك لوله عمل مي كند. بررسي محصولات تست به كمك كدورت سنجي تيوب ها مي باشد. براي انجام تست مذكور، از بيمار مشكوك به تولارمي خون گرفته مي شود و خون بايستي بلافاصله در تيوب حاوي ضد انعقاد مثل سيترات و … ريخته گشته تا لخته نگردد. از نمونه خون مشكوك، استخراج DNA باكتري با استفاده از كيت استخراج DNA صورت مي گيرد و در تكنولوژي LAMP استفاده مي گردد.

حوزه کاربرد (زمینه فنی)

این اختراع در زمینه های بیوتکنولوژی، میکروبیولوژی، بیولوژی مولکولی کاربرد دارد.

مشکل فنی موجود و هدف از این اختراع:

بیماری تولارمی در اثر باکتری فرانسیسلا تولارنسیس (Francisella tularensis) ایجاد می شود که این باکتری کوکوباسیل کوچک، غیرمتحرک، هوازی و گرم منفی است که دارای پوشش نازک لیپویلی ساکاریدی بوده و علیرغم عدم تولید اسپور از مقاومت بالایی برخوردار است و به مدت چندین هفته در دمای پایین در محیط آب، خاک مرطوب، علوفه، پوشال،کاه و اجساد در حال فساد حیوانات، زنده می ماند. تولارمی نوعی بیماری ميكروبي مشترک بین انسان و حیوانات است که براساس راه ورود و میزان ویرولانس عامل بیماری دارای تظاهرات بالینی گوناگونی در انسان می باشد. باکتری فرانسیسلا تولارنسیس قادر به آلوده کردن بیش از ۱۰۰ گونه از جانوران مانند انسان، جوندگان، ماهیان، حشرات است اما خرگوش به عنوان منبع اصلی بیماری شناخته شده‌است. این بیماری در سال 1911 به عنوان بیماری شبه طاعون جوندگان، توصیف شده است که توانایی ایجاد بیماری بالقوه شدید و کشنده در انسان با تلقیح یا استنشاق تعداد بسیار کمی از آن مثلاً حدود ده عدد را دارد. فرانسیسلا تولارنسیس قادر به ایجاد عفونت در انسان از طریق پوست، غشاهای مخاطی، دستگاه گوارش و ریه ها می باشد. این ارگانیسم نوعی باکتری داخل سلولی اجباری است که داخل ماکروفاژها تکثیر می یابد. مهمترین ارگان های هدف آن شامل غدد لنفاوی، ریه ها، پرده جنب، طحال، کبد و کلیه هاست.از آنجا که تولارمی انسانی، بیماری نسبتاً نادری است در صورت مواجه شدن با آن ممکن است بوسیله پزشکان با ظن قوی مطرح نگردد. شک به انتشار عمدی تولارمی زمانی حاصل میشود که دست اندرکاران امور بهداشتی با طغیان ناشی از یک بیماری حاد تنفسی همراه با ویژگی های اپیدمیولوژیک غیر معمول، مواجه شوند. باکتری فرانسیسلا تولارنسیس به عنوان یکی از جنگ افزارهای بیولوژیک خطرناک به شمار می آید که دارای خاصیت عفونت زایی شدید، قابلیت انتشار آسان و ظرفیت بالای ایجاد بیماری و مرگ می باشد، بنابراین در گروه A عوامل بیوتروریستی قرار دارد. این باکتری از ده ها سال قبل به عنوان يكي از عوامل بالقوه جنگ هاي بيولوژيك، مطرح بوده است. با توجه به اینکه پیش بینی وقوع حملات بیولوژیکی کاری بسیار دشوار می باشد و با توجه به اهمیت و ضرورت آمادگی مقابله با این حملات، مسئولان و متخصصین در این رابطه باید با آگاهی و هوشیاری لازم در جهت آمادگی در مقابل این خطرات تلاش و برنامه ریزی نمایند. جهت مقابله، آمادگی و آگاهی و شناسایی سریع عوامل بیولوژیکی در برابر حملات بیولوژیکی برای نیروهای مسلح کشورمان امری ضروری به نظر می رسد. زیرا کشور ایران نیز به خاطر داشتن موقعیت استراتژیکی همواره مورد ظلم و تهدید قرار گرفته است. از سوی دیگر احتمال استفاده و بکارگیری عوامل بیولوژیکی بویژه با بکارگیری عوامل عفونی که ریشه کن شده اند یا بسیار نادر می باشند، از جانب دشمن، دور از ذهن نمی باشد. کوکوباسیل تولارمی (فرانسیسلا تولارنسیس) جهت سواستفاده و سلاح بیولوژیکی مناسب است زیرا به آسانی قابل تولید و ذخیره سازی می باشد و قابلیت تبدیل به آئروسل را دارد و می تواند از طریق استنشاق هوا سبب آلودگی گردد. عامل آئروسل شده، محتمل ترین علت در حملات بیوتروریستی و مخرب ترین سناریوی بیوتروریسمی است. بنابراین ایجاد نیروهای واکنش سریع و کمیته های تخصصی مقابله با حملات بیولوژیکی و همچنین سرمایه گذاری برروی طرح های مقابله با این حملات در بخش نیروهای مسلح بیش از پیش احساس می گردد. بدیهی است که تهیه و استفاده از کیت های تشخیصی سریع و مناسب یکی از بهترین گزینه ها در برابر رخدادهای حملات بیولوژیک می باشد. برای دفاع در برابر عوامل بیولوژیک یکی از مهم ترین اقدامات، تشخیص سریع حملات بیولوژیک، شناسایی عامل به کار رفته و شروع درمان می باشد. همچنین شناسایی عوامل عفونی که مشخصات کلینیکی خاصی ندارند اغلب بدون تشخیص باقی مانده و یا با سایر پاتوژن ها به اشتباه گرفته می شوند. درحالی که تشخیص خط اول درمان می باشد و تشخیص زود هنگام می تواند از مرگ و میر و حتی آسیب های غیر قابل جبران پیشگیری نماید.

ارایه راه حل برای مشکل فنی موجود همراه با شرح دقیق و کافی و یکپارچه اختراع

تکنیک تکثیر هم دما به واسطه حلقه (Loop Mediated Isothermal Amplification) یا (LAMP) یک روش تکثیری و مولکولی منحصر به فرد بوده که در این روش DNA باکتری می تواند در شرایط هم دما (یک دما) و تنها با استفاده از یک آنزیم تکثیر یابد و به دناتوراسیون DNA الگو (مانند PCR) نیازی نیست. همچنین از نمونه ها به طور مستقیم در این واکنش می توان استفاده نمود. طراحی یک روش جدید بر اساس تکنولوژی LAMP برای تشخیص دقیق و سریع باکتری فرانسیسلا تولارنسیس عامل بیماری تولارمی، جهت تشخیص آن بدون نیاز به میکروسکوپ، تست های سرولوژیکی و یا استفاده از روش های مولکولی گران قیمت مانند PCR، بسیار حائز اهمیت می باشد. تکنولوژی LAMP بر اساس پرایمرهای اختصاصی که توسط نرم افزار آنلاین Primer explorer طراحی می شود، می باشد. نرم افزار آنلاین Primer explorer نرم افزار رایگان و در دسترسی می باشد و همانگونه که در مقالات مرتبط با LAMP قابل مشاهده است، یکی از رایج ترین نرم افزارهای طراحی پرایمر LAMP می باشد. در این مطالعه از ژن fopA جهت طراحی پرایمرها استفاده شد. ژن fopA ژن کانزرو شده در باکتری فرانسیسلا تولارنسیس می باشد و مطالعه بیوانفورماتیکی و بلاست پرایمرها انجام شد، و هر چهار پرایمر طراحی شده ژن fopA در باکتری فرانسیسلا تولارنسیس را شناسایی کردند. مبتنی به تکنولوژی LAMP و با استفاده از بانک های اطلاعاتی میکروارگانیسم های بیماریزا، ترادف های اختصاصی شناسایی این باکتری طراحی و سپس توسط شرکت سنتز گشت.همچنین مواد مورد نیاز شیمیایی و واکنشگرهای لازم، انتخاب و روش کیت تشخیص سریع بیماری تولارمی بر پایه ی LAMP ابداع گردید و با استفاده از روش آلوده سازی مصنوعی (به دلیل در دسترس نبودن نمونه بیمار)، نمونه خون سالم انسانی را با ژن باکتری فرانسیسلا تولارنسیس آلوده کرده و استخراج DNA با کیت سیناکلون صورت گرفت. پس از تهیه و آماده کردن نمونه، مخلوط واکنشگر (که شامل: بتائین- تووین- بافر آنزیم- MgCl2 می باشد)، پرایمرها و آنزیم Bst DNA Polymerase را به تیوب حاوی نمونه اضافه می کنیم. در نهایت تیوب ها را در دستگاه ترموبلاکی مثل بن ماری که دمای 65 درجه سانتی گراد را به مدت 45 دقیقه فراهم کند قرار داده تا فرآیند تکثیر با تکنیک LAMP صورت پذیرد. در صورت مثبت بودن آزمایش LAMP، تکثیر بسیار زیادی از ترادف اختصاصی باکتری صورت می گیرد و کدروت قابل مشاهده ای با چشم غیر مسلح ایجاد می گردد. همچنین به علت تولید بسیار زیاد یون پیروفسفات که محصول فرعی در این واکنش می باشد، تیوب ها را سانتریفیوژ نموده و رسوب سفید دکمه ای شکل نمایان می گردد. همین طور با اضافه کردن رنگ فلئورسنس کلسئین (قبل از شروع واکنش) و مشاهده تغییر رنگ (پس از اتمام واکنش) با چشم غیر مسلح از رنگ نارنجی (واکنش منفی) به رنگ سبز (واکنش مثبت) می توان تشخیص قطعی داد. در صورت دلخواه نیز می توان از آنالیز الکتروفورز در ژل آگاروز 2% و مشاهده باندهای Ladder Like (در صورت مثبت شدن آزمایش) استفاده شود. جهت بهینه سازی دمای تست LAMP ، آزمایش در سه دمای 60، 62.5 و 65 درجه سانتی گراد گذاشته شد که دمای 65 درجه سانتی گراد بهترین دما جهت انجام واکنش شناخته شد. سپس جهت بهینه سازی زمان، واکنش در سه زمان 30، 45 و 60 دقیقه بررسی شد که مدت زمان 45 دقیقه حداقل زمان مورد نیاز جهت انجام واکنش معین گشت.