خلاصه اختراع

تب بازگرد ناشي از كنه (TBRF) بيماري حاد عفوني است كه توسط چندين گونه از باكتري بورليا كه ناقلشان كنه هاي نرم از جنس اورنيتودوروس مي باشد، ايجاد مي شود. سير بيماري شامل حملات متناوب تب است كه با فواصل چند روزه بدون تب از هم متمايز مي شوند و عوارضي چون درگير كبد، كليه و دردهاي عضلاني را به همراه دارد. مهمترين عارضه ايجاد شده، عوارض عصبي است كه شامل فلج چشم، مننژيت، فلج نصف بدن، آنسفاليت و درگيري اعصاب نخاعي است. يكي از مشكلات موجود در رابطه با اين بيماري عدم تعيين آلودگي با توجه به علائم باليني است. تب بازگرد ناشي از كنه بيماري است كه به صورت اندميك در ايران وجود دارد، 1415 مورد از سال 1997 تا 2006 در كشور گزارش شده است. بورليا ميكروتي به عنوان عامل مهمي در ايجاد TBRF در ايران و خاورميانه مي باشد. شناسايي گونه بورليا به طور متداول با تزريق انگل به حيوان حساس آزمايشگاهي و بررسي ميكروسكوپي خون حيوان پس از 7-10 روز انجام مي شود كه بسيار ناكارامد و طولاني مدت است و امكان چنين آزمايشي در آزمايشگاه هاي مراكز بهداشتي مناطق بومي و آزمايشگاه هاي تشخيص طبي وجود ندارد. هم چنين با توجه به طولاني بودن زمان آزمايش، عدم ايجاد آلودگي در حيوان آزمايشگاهي در صورت كم بودن ميزان باكتري و موارد منفي اشتباه، امروزه از روش هاي جايگزين به ويژه روش هاي مولكولي PCR استفاده مي شود. يكي از مهم ترين معايب PCR ، پرهزينه بودن آن (نياز به تجهيزات پيشرفته دقيق و عمدتاً گران قيمت) مي باشد. همچنين روش ها و مراحل تشخيص نهايي محصول PCR عمدتاً وقت گير و دشوار مي باشند، به علاوه به دليل توليد مقدار زياد DNA احتمال آلودگي آزمايشگاهي نيز وجود دارد. با توجه به اين كه در كشور ما مطالعات محدودي در مورد بورليا ميكروتي شده است و روش هاي سريع و دقيق و ارزان در تشخيص اين باكتري وجود ندارد و با توجه به اهميت تشخيص و درمان زود هنگام اين باكتري به خصوص در مناطق اندميك براي جلوگيري از شيوع و عوارض جانبي بيماري، ضرورت در ارائه يك روش دقيق و سريع و با هزينه كمتر در كشور وجود دارد. تكنولوژيLAMP روش دقيق و سريع در جهت تشخيص پاتوژن ها حتي در حالت زنده و غير قابل كشت مي باشند كه باعث كنترل سريع عفونت و كاهش عوارض و مرگ و مير ناشي از آن مي شود. تكنولوژيLAMP طي مدت زمان 60 دقيقه قدرت تشخيص دارد، در حاليكه در روش هاي مولكولي ديگر 3-4 ساعت طول مي كشند. در مقايسه با PCR ، تكنولوژيLAMP به تجهيزات ساده تري نياز دارد و با استفاده از يك بلوك حرارتي كه دماي 65 درجه سانتي گراد را فراهم مي كند قابل انجام است. بر خلاف PCR كه نياز به آناليز الكتروفورز دارد، نتايج LAMP با چشم غير مسلح (مشاهده كدورت) قابل مشاهده است. حتي آزمايشگاه ميكروبيولوژي كه تاكنون از روش مولكولي ديگر مثل PCR استفاده نكرده است مي تواند اين روش را براي كاربرد روزمره معرفي كند.

حوزه کاربرد (زمینه فنی)

این اختراع در زمینه های بیوتکنولوژی، میکروبیولوژی، بیولوژی مولکولی کاربرد دارد.

مشکل فنی موجود و هدف از این اختراع:

بیماری تب بازگرد ناشی از کنه (Tick Born Relapsing Fever, TBRF) بیماری حاد عفونی است که توسط چندین گونه از باکتری بورلیا که ناقلشان کنه های نرم از جنس اورنیتودوروس می باشد، ایجاد می شود. سیر بیماری شامل حملات متناوب تب است که با فواصل چند روزه بدون تب از هم متمایز می شوند و عوارضی چون درگیری کبد، کلیه و دردهای عضلانی را به همراه دارد. مهمترین عارضه ایجاد شده، عوارض عصبی است که شامل فلج چشم، مننژیت، فلج نصف بدن، آنسفالیت و درگیری اعصاب نخاعی است. تب بازگرد ناشی از کنه بیماری است که به صورت اندمیک در ایران وجود دارد، 1415 مورد از سال 1997 تا 2006 در کشور گزارش شده است. پراکندگی کنه های اورنیتودوروس اراتیکوس (ناقل باکتری بورلیا میکروتی) در ناحیه وسیعی از مرکز و جنوب کشور می باشد. بورلیا میکروتی به عنوان عامل مهمی در ایجاد TBRF در ایران و خاورمیانه می باشد. هدف از این اختراع ارائه روشی حساس بر پایه تکنولوژی LAMP با توانایی تشخیص کمترین تعداد باکتری بورلیا میکروتی با استفاده از نمونه های مستقیم بالینی بدون نیاز به کشت، تشخیص دقیق و سریع و در عین حال کم هزینه در انسان می باشد.

ارایه راه حل برای مشکل فنی موجود همراه با شرح دقیق و کافی و یکپارچه اختراع

تکنیک تکثیر هم دما به واسطه حلقه (Loop Mediated Isothermal Amplification) یا (LAMP) یک روش تشخیصی و مولکولی منحصر به فرد بوده که در این روش ناحیه اختصاصی ژنوم باکتری در شرایط هم دما (یک دما) و تنها با استفاده از یک آنزیم تکثیر می شود و به واسرشت سازی الگو (مانند PCR) نیازی نیست. همچنین از نمونه های بالینی به طور مستقیم در این واکنش می توان استفاده نمود. با توجه به موارد فوق الذکر، طراحی یک روش جدید بر اساس تکنولوژی LAMP برای تشخیص دقیق و سریع باکتری بورلیا میکروتی عامل تب بازگرد ناشی از کنه در ایران و خاورمیانه (جهت تشخیص آن بدون نیاز به میکروسکوپ، تزریق نمونه به حیوان آزمایشگاهی و یا استفاده از روش های مولکولی گران قیمت مانند PCR) بسیار حائز اهمیت می باشد. تکنولوژی LAMP بر اساس 6 پرایمر اختصاصی FIP(Forward Inner Primer)- BIP(Backward Inner Primer) -F3(Forward Outer Primer) -B3(Backward Outer Primer) – LF(Forward Loop Primer)- LB(Backward Loop Primer) که توسط نرم افزار آنلاین Primer explorer طراحی می شود، می باشد. مبتنی به تکنولوژی LAMP و با استفاده از بانک های اطلاعاتی میکروارگانیسم های بیماریزا، ترادف های اختصاصی شناسایی این باکتری طراحی و سپس سنتز گردید. همچنین مواد مورد نیاز شیمیایی و واکنشگرهای لازم، انتخاب و نهایتا کیت تشخیصی بر پایه ی LAMP ابداع گردید. برای استفاده از این کیت ابتدا از بیمار مشکوک به تب بازگرد خون گرفته می شود (خون باید بلافاصله در تیوب حاوی ضد انعقاد مثل سیترات یا هپارین و … ریخته می شود تا لخته نگردد). نمونه خون مشکوک به صورت های متفاوتی آماده و پردازش و سپس با استفاده از روش ابداعی بررسی می گردد؛ (1) استخراج DNA باکتری با استفاده از کیت استخراج DNA . (2) استفاده از کارت های نگهداری DNA و استفاده مستقیم آن در کیت موضوع این اختراع. پس از تهیه و آماده کردن نمونه، مخلوط واکنشگر (که شامل: بتائین- توئین- بافر آنزیم- MgCl2 می باشد)، پرایمرها و آنزیم Bst DNA Polymerase را به تیوب حاوی نمونه اضافه می کنیم. در نهایت تیوب ها را در هر نوع دستگاه حرارتی (مثل بن ماری) که دمای 65°C را به مدت یک ساعت فراهم کند قرار داده تا فرآیند تکثیر صورت پذیرد. در صورت مثبت بودن آزمایش (وجود باکتری در نمونه خون بیمار)، تکثیر بسیار زیادی از ترادف اختصاصی باکتری صورت می گیرد و در نتیجه کدروت قابل مشاهده ای با چشم غیر مسلح ایجاد می گردد. همچنین می توان تیوب ها را سانتریفیوژ نموده و رسوب سفید دکمه ای شکل را در ته لوله مشاهده نمود. همین طور با اضافه کردن رنگ فلئورسنس کلسئین (قبل از شروع واکنش) و مشاهده تغییر رنگ (پس از اتمام واکنش) با چشم غیر مسلح از رنگ نارنجی (واکنش منفی) به رنگ سبز (واکنش مثبت) می توان تشخیص قطعی داد. در صورت دلخواه نیز می توان از آنالیز الکتروفورز در ژل آگاروز 2% و مشاهده باندهای Ladder Like (در صورت مثبت شدن آزمایش) استفاده می شود.